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堿性蛋白非變性PAGE凝膠制備及電泳試劑盒
 產品貨號: RTD6131
 產品名稱: 堿性蛋白非變性PAGE凝膠制備及電泳試劑盒
 產品價格/規格: 50次 500元
 產品說明書: 點擊查看
 更新時間: 2019-08-08
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    10×堿性蛋白Native PAGE轉膜緩沖液

    堿性蛋白非變性電泳蛋白Marker



    堿性蛋白非變性PAGE凝膠制備及電泳試劑盒(貨號:RTD6131

                                        Basic Protein Native PAGE Gel Preparation and Electrophoresis Kit

    產品組成:

    貨號

    名稱

    規格

    保存條件

    AC2913-01

    30%PAA(29:1)

    100 ml

    4,避光

    RTD6131-02

    4×堿性蛋白分離膠緩沖液 pH4.3

    100 ml

    4

    RTD6131-03

    4×堿性蛋白濃縮膠緩沖液 pH6.8

    30 ml

    4

    RTD6131-04

    100×分離膠促凝劑

    2.5 ml

    -20

    AP020P

    APS(干粉)

    0.5 g

    RT

    TA0761-01

    TEMED

    0.5 ml

    4,避光

    PL110

    甲基綠上樣緩沖液

    1 ml

    -20

    TG160P

    堿性蛋白電泳緩沖液(干粉)

    1 L

    RT

    產品簡介:

    本公司提供的試劑盒包含堿性蛋白凝膠制備及電泳所需的全部試劑,用戶只需自備制膠器具和蒸餾水。本試劑盒可用于配制堿性蛋白非變性(native)PAGE凝膠。本試劑盒可配制30-50塊常規大小的非變性PAGE膠。

    各種蛋白質分子由于所含的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數目不同,因而有各自的等電點。凡堿性氨基酸含量較多的蛋白質稱為堿性蛋白質,等電點偏堿性,如組蛋白、精蛋白等。反之,凡酸性氨基酸含量較多的蛋白質,等電點就偏酸性。分離堿性蛋白時候,要利用低 pH 凝膠系統,分離酸性蛋白時候,要利用高 pH 凝膠系統。酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的 pH 是 8.8的緩沖系統,蛋白會帶負電荷,蛋白會相陽極移動;而堿性蛋白通常電泳是在微酸性環境下進行,蛋白帶正電荷,這時候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。

    特別說明:由于本系統采用非連續凝膠系統,分離膠pH為4.3,因此要求待分離的蛋白等電點pI>7.0,這樣堿性蛋白在酸性凝膠系統內帶正電荷,在凝膠電泳中才能正常向陰極泳動。如果待分離的蛋白等電點pI<7.0,請選擇非連續Laemmli活性凝膠系統分離(貨號:RTD6130)。

    使用說明:

    配制分離膠

    根據目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度(表一),配制非變性PAGE的分離膠。


    表一 不同濃度的PAGE分離膠的最佳分離范圍

    PAGE分離膠濃度

    最佳分離范圍

    6%

    50-150kD

    8%

    30-90kD

    10%

    20-80kD

    12%

    12-60kD

    15%

    10-40kD



    配制分離膠前,根據以下配方準備10% APS:

    10% APS配制-5 ml

    將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中,徹底溶解后分裝,1 ml/支,-20℃備存,每次取一管使用。10% APS應盡量減少室溫存放時間,以防失效。10%APS在4℃有效期為一周,-20℃有效期6個月。若發現凝膠聚合時間延長,應考慮更換使用-20度保存的10% APS。

    制備分離膠步驟:

    1.參照凝膠模具說明書,裝配好凝膠模具。

    2.根據下表,將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合,輕輕攪拌使其混勻,避免產生氣泡

    3.在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層,使凝膠表面保持平整。

    4.靜置15-30分鐘,待分離膠和水層之間出現一個清晰的界面后,說明凝膠已聚合。

    注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

    配制不同體積的 8%分離膠所需各組分的體積(毫升)

    凝膠總體積(ml

    5 ml

    10 ml

    15 ml

    20 ml

    30 ml

    組份

    組份加入體積(ml

    滅菌水

    2.4

    4.7

    7.1

    9.5

    14.2

    4×分離膠緩沖液 pH4.3

    1.25

    2.5

    3.75

    5

    7.5

    30 PAA29:1

    1.3

    2.7

    4

    5.3

    8

    100×分離膠促凝劑

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    10 APS

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    TEMED

    0.005

    0.01

    0.015

    0.02

    0.03

    配制不同體積的 10%分離膠所需各組分的體積(毫升)

    凝膠總體積(ml

    5

    10

    15

    20

    30

    組份

    組份加入體積(ml

    滅菌水

    2

    4.1

    6.1

    8.1

    12.2

    4×分離膠緩沖液 pH4.3

    1.25

    2.5

    3.75

    5

    7.5

    30 PAA29:1

    1.7

    3.3

    5

    6.7

    10

    100×分離膠促凝劑

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    10 APS

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    TEMED

    0.005

    0.01

    0.015

    0.02

    0.03

    配制不同體積的 12%分離膠所需各組分的體積(毫升)

    凝膠總體積(ml

    5

    10

    15

    20

    30

    組份

    組份加入體積(ml

    滅菌水

    1.7

    3.4

    5.1

    6.8

    10.2

    4×分離膠緩沖液 pH4.3

    1.25

    2.5

    3.75

    5

    7.5

    30 PAA29:1

    2

    4

    6

    8

    12

    100×分離膠促凝劑

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    10 APS

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    TEMED

    0.005

    0.01

    0.015

    0.02

    0.03

    配制不同體積的 15%分離膠所需各組分的體積(毫升)

     

    凝膠總體積(ml

    5 ml

    10 ml

    15 ml

    20 ml

    30 ml

    組份

    組份加入體積(ml

    滅菌水

    1.2

    2.4

    3.6

    4.8

    7.2

    4×分離膠緩沖液 pH4.3

    1.25

    2.5

    3.75

    5

    7.5

    30 PAA29:1

    2.5

    5.0

    7.5

    10

    15

    100×分離膠促凝劑

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    10 APS

    0.05

    0.1

    0.15

    0.2

    0.3

    TEMED

    0.005

    0.01

    0.015

    0.02

    0.03

    濃縮膠制備:

    1.去除覆蓋在分離膠上的水層。

    2.按照表三將不同成分在一個小燒杯或試管中混合,輕輕攪拌使其混勻,避免產生氣泡。

    3.將濃縮膠溶液加至分離膠的上面,直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。

    4.將梳子插入凝膠內,避免產生氣泡。

    5.靜置30-60分鐘,等待濃縮膠聚合。

    注:凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長。可以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。

    表三 堿性蛋白Native PAGE濃縮膠(5%)配方表

    組份

    不同凝膠體積對應各組份的取樣量(ml

    2 ml

    4 ml

    6 ml

    10 ml

    H2O

    1.15

    2.3

    3.4

    5.7

    4×堿性蛋白濃縮膠緩沖液 pH6.8

    0.5

    1

    1.5

    2.5

    30 PAA29:1

    0.33

    0.67

    1

    1.7

    TEMED

    0.002

    0.004

    0.006

    0.01

    10 APS

    0.02

    0.04

    0.06

    0.1

    電泳:

    凝膠凝固好后,根據以下配方準備電泳緩沖液。

    堿性蛋白電泳緩沖液的配制-1 L:將5×堿性蛋白電泳緩沖液干粉全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,加入冰醋酸11ml,用水定容至1 L,即配成5×堿性蛋白電泳緩沖液(此溶液pH值約為4.4)。

    將5×堿性蛋白電泳緩沖液稀釋5倍即配成1×堿性蛋白電泳緩沖液。在電泳槽的內槽內加入1×堿性蛋白電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔),輕輕的撥出梳子,沖洗加樣孔,隨后在電泳槽外槽加入適量的1×堿性蛋白電泳緩沖液。上樣,把電泳電源的電源線互換,即紅色的陽極電極查到陰極孔,黑色的陰極電極插到陽極孔,按照表四條件,電泳,等指示前沿甲基綠電泳到分離膠下緣后,結束電泳,染色或者進行下一步實驗。     表四 堿性蛋白電泳條件

    恒電壓

    150V

    起始電流

    30-40mA/板膠

    結束電流

    10-20mA/板膠

    電泳時間

    40-45分鐘






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